Der Spieler hat die Möglichkeit, sich selbst oder Gegenstände zu teleportieren, um damit bestimmte Aufgaben zu lösen. Zu Beginn des Spiels erlangt der Spieler nach und nach Kontrolle über das Aperture Science Handheld Portal Device, ein Gerät mit dem blaue oder orangefarbene Teleportationsportale per Schuss auf einer geeigneten Oberfläche erstellt werden können. Zu jedem Zeitpunkt kann nur höchstens ein Portal jeder Farbe existieren, ein neues ersetzt das alte. Materie auch lebende, wie zum Beispiel der Spieler und Licht kommen nach dem Eintritt in ein Portal ohne Zeitverzögerung aus dem anderen wieder heraus, Geschwindigkeit und Ausrichtung (bzw. Impuls und Drehimpuls) bleiben dabei unter Berücksichtigung des „Portal-Effekts“ erhalten. Zeigen beispielsweise die Portale in unterschiedliche Himmelsrichtungen, läuft man trotzdem aus dem Zielportal „geradeaus“ heraus, wenn man ins Ursprungsportal „geradeaus“ hineingelaufen ist:
Die Farbe dient nur der Unterscheidbarkeit, beide Portale können in beide Richtungen genutzt werden. Auch ein Verweilen „innerhalb“ der Portale ist möglich. Existieren beide Portale, sind nur deren Ränder farbig und man kann, wie durch ein Fenster, durch sie hindurch aus dem jeweils anderen Portal herausblicken.
Durch diese Eigenschaften hat der Spieler viele Möglichkeiten, Hindernisse wie säuregefüllte Schluchten, Metall- oder Glaswände zu umgehen. Eine fortgeschrittene Technik besteht darin, in Decke und Boden übereinander liegende Portale zu erstellen, durch die man im freien Fall eine hohe Geschwindigkeit aufbauen kann, um dann das Deckenportal umzusetzen und dank der eigenen Trägheit sehr weit oder hoch geschleudert zu werden.
Vom Spieler geht in Portal keine Gewalt gegen Menschen aus, allerdings schwebt die Protagonistin während des Spieles aufgrund des feindseligen Computer Gegenspielers oft in Lebensgefahr. Das Blut des Hauptcharakters ist dabei in der deutschen Version – wie bei Team Fortress 2 und Half-Life 2: Episode Two auch grau eingefärbt.
Der Spieler übernimmt die Kontrolle über Chell:
Eine junge Frau, die als Testsubjekt für die Forschungseinrichtung Aperture Science Enrichment Center der Aperture Laboratories fungiert. Aperture Laboratories ist ein Konkurrenzunternehmen der Black Mesa Research Facility, in der Half-Life spielt.
Die Handlung beginnt in einem nur mit dem Nötigsten ausgestatteten Glaskubus. In dieser sterilen, mit Überwachungskameras versehenen Umgebung wird der Spieler von der weiblichen Computerstimme des Genetic Lifeform and Disk Operating System „GLaDOS“ begrüßt und aufgefordert, an Tests teilzunehmen:
Diese bestehen aus als „Testkammern“ bezeichneten Hindernisparcours, in denen unter anderem würfelformige Boxen gesucht und auf Bodenschaltern abgelegt werden müssen. Als Belohnung für den erfolgreichen Abschluss aller 19 Kammern wird immer wieder ein Kuchen versprochen.
Schnell zeigt sich, dass GLaDOS über eine gespaltene Persönlichkeit verfügt, die zwischen Fürsorglichkeit, Gleichgültigkeit und später auch Feindseligkeit schwankt. Die Testkammern werden durch Säurebecken, Energiestrahlen und Selbstschussanlagen zunehmend lebensgefährlich. Neben kurzen Aussetzern GLaDOS' und ihrer Fähigkeit, Euphemismen zu verwenden und zu lügen, wirken auch kleine Areale abseits der eigentlichen Testkammern beunruhigend. Dort befinden sich neben aus Computern improvisierten Kochern und Nahrungsvorräten Notizen wie „She's watching you!“ („Sie beobachtet dich!“) oder „The cake is a lie!“ („Der Kuchen ist eine Lüge!“) an den Wänden dieser relativ schmutzigen, düsteren Räume.
Am Ende der letzten Testkammer soll Chell auf einer beweglichen Plattform in eine Brennkammer gefahren und getötet werden laut GLaDOS' Aussage braucht sich die Protagonistin um die Ausrüstung von Aperture Science keine Sorgen zu machen, da sie für derart hohe Temperaturen ausgelegt sei. Chell kann aber dank des Portal Devices entkommen. Die letzten Abschnitte des Spiels handeln – begleitet von den wie gewohnt wechselmütigen und unterhaltsamen Kommentaren der nun deutlich verärgerten GLaDOS – von der Flucht durch die Wartungsareale des Enrichment Centers, die keine Ähnlichkeiten mit den sterilen Testkammern aufweisen. Auch in den Wartungsarealen begegnet Chell des Öfteren Notizen der Person, die schon vorher die Wände bekritzelt hatte. Neben Notizen hat diese Person an manchen Stellen auch Pfeile an die Wand gekritzelt, die dem Spieler den Weg zeigen.
Chell findet GLaDOS' vermeintlichen Systemkern und in einem abschließenden Kampf gelingt es ihr, den Computer zu zerstören. Sie wird ohnmächtig und wacht anscheinend gerettet auf dem Parkplatz des Geländes zwischen brennenden Trümmern auf. Im Enrichment Center aktivieren sich einige Systeme, und ein Greifarm löscht die Kerze eines bereitstehenden Kuchens. Im Abspann singt GLaDOS, dass sie sich über den Erfolg Chells freue und weiterforschen werde, denn sie lebe und es gehe ihr gut (Der Titel des Lieds ist Still Alive):
Es bleibt unklar, ob die zweite Hälfte der Handlung mit der Flucht zum eigentlichen Test von GLaDOS gehört oder nicht.
Die Handlung selbst erzählt nur wenig über das Universum von Half-Life. Die einzigen Hinweise darauf sind eine projizierte Präsentation in einem verlassenen Konferenzraum, in dem die Forschungseinrichtung Black Mesa als Konkurrent dargestellt wird sowie eine Erwähnung dieser im (humorvollen) Abschlusslied. In der (zusammen mit Portal veröffentlichten) Episode 2 von Half-Life 2 wird am Ende das Schiff Borealis von Aperture Science als Ziel der nächsten Episode offenbart.
